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可赏、可食用,可美白,抗衰老的蓝莲花之:

发布时间:2019-03-18  阅读:600次
 香水莲花肌肤美白抗衰老实验
世界中联中药养颜 
目 前 市 场 有 多 种 皮 肤 美 白 剂 ,如 纯 化 学 物 氢 醌 ,天 然 植 物 提 取 物 熊 果 苷 、
甘 草 提 取 物 等 。纯 化 学 物 的 美 白 效 果 较 好 ,但 往 往 会 带 来 一 些 副 作 用 ,而
天 然 植 物 提 取 物 由 于 安 全 性 高 ,越 来 越 得 到 研 发 者 和 消 费 者 的 青 睐 。
皮 肤 的 美 白 主 要 两 种 方 式 :
一 是 抑 制 黑 色 素 合 成 酶 的 活 性 ,如 抑 制 酪 氨 酸 酶 ,多 巴 色 素 互 变 酶 等 ,以
减 少 黑 色 素 的 生 成 ;
二 是 促 进 黑 色 素 排 出 ,如 促 进 黑 色 素 的 吸 收 代 谢 等 。
天 然 植 物 提 取 物 的 美 白 作 用 通 常 是 通 过 抑 制 酪 氨 酸 酶 活 性 或 阻 断 酪 氨 酸
生 成 黑 素 的 氧 化 反 应 ,从 而 减 少 黑 素 的 合 成 而 达 到 美 白 皮 肤 的 效 果 。
香 水 莲 花 (Nymphaeahybrid)是 睡 莲 科 睡 莲 属 热 带 大 型 睡 莲 ,既 是 一 种
大 型 观 赏 性 花 卉 ,又 可 安 全 食 用 ,源 于 香 水 莲 花 的 各 种 产 品 也 被 不 断 开 发
利 用 。
本 文 通 过 测 定 比 较 提 取 物 对 酪 氨 酸 酶 活 性 的 影 响 ,筛 选 获 得 效 果 较 好 的
提 取 物 ,再 应 用 B16黑 素 瘤 细 胞 模 型 ,进 一 步 研 究 香 水 莲 花 提 取 物 对 细
胞 黑 素 合 成 的 影 响 及 其 对 细 胞 内 酪 氨 酸 酶 的 作 用 ,初 步 探 讨 其 美 白 作 用 ,
以 期 为 纯 天 然 美 白 化 妆 品 的 开 发 提 供 理 论 参 考 。
一、实验方法
1香 水 莲 花 样 品 的 制 备
分别取晒干后的黄色、蓝色香水莲花整花。按照 1g∶10mL料液质量体积比,分
别用蒸馏水、体积分数 20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液(V/V)在 50℃
温度下超声浸提 30min,所得溶液 4000r/min离心 15min,取上清液过滤,再经
减压旋蒸除去乙醇,冻干 48h,得到香莲整花提取物粉末。
测定时将其与子房提取物经过超声重溶配制成所需浓度的溶液待用。
2香 水 莲 花 提 取 物 的 活 性 成 分 测 定
2.1总酚质量分数的测定没食子酸标准曲线测定:
采用 Folin-Ciocalteu法。精密吸取没食子酸标准溶液(0.1mg/mL)0.1、0.2、0.3、
0.4、0.5、0.6mL于 10mL具塞试管中,加入 1.0mLFolin-Ciocalteu试剂和
2mL15%Na2CO3溶液,用蒸馏水定容至 10mL,充分混匀后于 75℃水浴 30min,
以试剂空白为参照,在 760nm波长下测定吸光度。
以吸光度为纵坐标(y,A760),没食子酸质量为横坐标(x,mg)绘制标准曲线,
得到回归方程 y=14.7x-0.0005(R2=0.9998)。
香水莲花提取物总酚质量分数测定:
将各提取物配成 1.0mg/mL的待测液,取 0.2mL待测液,按上述步骤测定,根据
标准曲线计算提取物干基总酚质量分数。
2.2黄酮质量分数的测定
芦丁标准曲线测定:
精密称取 105℃常压干燥至恒重的芦丁标准品 0.1002g,用体积分数 50%乙醇定
容至 50mL作为母液。正确吸取芦丁母液 1.5、2.5、4.0、5.0、8.0、10.0mL置于
25mL容量瓶中,以体积分数 50%乙醇定容。
吸取 2mL芦丁标准液,加入 2mL质量分数 1%三氯化铝,振荡摇匀后室温放置
15min,以溶剂加质量分数 1%三氯化铝溶液作为空白对照在 425nm处测定吸光
值。
以吸光值为纵坐标(y,A425nm),芦丁质量为横坐标(x,μg)绘制标准曲线,得
回归方程 y=0.0112x+0.0099(R2=0.9995)。
将各提取物配成 1.0mg/mL的母液,再将整花提取物母液用体积分数 50%乙醇稀
释一倍作为待测液,子房提取物母液作为待测液,按照上述标准曲线方法测定,
根据标准曲线计算提取物干基黄酮质量分数。
3香 水 莲 花 提 取 物 的 美 白 功 效 测 定
3.1抑制酪氨酸酶活性测定
采用体外法测定。总反应体系为 5mL,具体设计见表 1。
其中,用分光光度计测量吸光值时,受试组、空白组、熊果苷对照组分别以阴性对
照组 1#、2#和 3#管调零。
实验时,向试管中依次加入磷酸盐缓冲液、不同浓度梯度的样品液和酶液,37℃
水浴 10min后加入底物 L-酪氨酸,立即计时。反应 20min时测定 475nm波长下
的吸光值。
测定时以相应的阴性对照为参比,用下列公式计算样品液和阳性对照对酪氨酸酶
的抑制率,依据浓度-酶抑制率曲线计算半抑制浓度(IC50),IC50值低则表明其
对酪氨酸酶活性的抑制效果好。
3.2细胞形态观察
B16小鼠黑素瘤细胞株购于上海市中科院细胞库。每次实验取自同一传代细胞,
DMSO质量分数小于 0.5%。
取指数生长期的 B16黑色素瘤细胞,经 0.25%胰蛋白酶消化分散,调整细胞密度
为 5×104个/mL,每孔 100μL接种于 96孔板,再补充 RPMI1640新鲜培养液
100μL,培养 12h待细胞完全贴壁后更换新培养基,每孔加入 200μL不同浓度的
受试物溶液,每个浓度设置 6个复孔,对照组加入新鲜培养液代替美白剂溶液,
每天换液,培养 48h后置于显微镜下观察对照组和实验组的细胞大小、形态、生
长密度、树突形态以及融合状态等,并拍照记录。
3.3MTT比色法检测细胞增殖率
细胞悬浮液前处理同上,细胞接种 12h后用添加受试美白剂的新鲜培养液换液
(各设 4个剂量组,香水莲花乙醇体积分数 60%提取物和熊果苷的质量浓度梯度
为 12.5、25、50、100μg/mL),每孔加入 200μL,每个质量浓度设置 6个复孔,
对照组加入新鲜培养液代替美白剂溶液,培养 48h。
在测定时间前 4h取出,每孔加入 5mg/mLMTT溶液 20μL,在培养箱中继续孵育
4h,然后弃去培养基和 MTT,向各孔中加入 150μL的 DMSO,以溶解残留的 MTT-
甲臜结晶,震荡混匀后用酶标仪测定 570nm下的吸光值。
细胞增殖率按以下公式计算:
细胞增殖率(%)=(A实验孔-A空白孔)/(A对照孔 A空白孔)×100%。
3.4黑素质量分数测定
选择对数生长期细胞制成单细胞悬液,以 5×104个/mL接种于 6孔培养板,每孔
2mL。贴壁后每孔分别加不同质量浓度含受试美白剂的培养基(质量浓度梯度为
12.5、25、50、100μg/mL),以不含受试美白剂的空白培养基作为对照。
将细胞在 37℃、体积分数 5%CO2饱和湿度条件下培养 48h,倾去培养液,用 PBS
缓冲液洗 1次,质量分数 0.25%胰酶消化,再用 PBS缓冲液吹打沉淀细胞,备用。
取备用细胞悬液加 PBS缓冲液,各吸取 1mL细胞悬液分别置于离心管中,低速
离心10min后弃去上清液,先加入200μL蒸馏水使细胞重新悬浮,然后加入1mLV
(乙醇)∶V(乙醚液)=1∶1,在室温下放置 15min,3000r/min离心 5min并弃
去上清液,加入 1mL含体积分数 10%二甲基亚砜的 1mol/LNaOH溶液,然后置
于 80℃水浴 30min,最后转移到 96孔板中,用分光光度计在 470nm波长处测定
吸光度,单个细胞内相对黑素质量分数=(A实验组/A对照组)/细胞增殖率×100%。
3.5酪氨酸酶活性抑制率测定
细胞前处理同上,调整细胞数为 5×104个/ml,96孔板每孔加细胞悬液 100μL,
再补充培养液 100μL,铺板 12h后,弃上清,加入 200μL含不同质量浓度美白剂
的培养液(质量浓度梯度为 12.5、25、50、100μg/mL),在 37℃,体积分数 5%CO2
饱和湿性条件下培养,每一质量浓度设 6个复孔,以不添加美白剂培养的细胞作
为空白对照,培养 48h,每天换液。
采用多巴氧化法对酪氨酸酶活性进行测定。将孔板中上清液弃去,用 PBS缓冲液
漂洗后每孔加入 1%Triton-X10040μL,迅速放入-80℃冰箱内,30min后取出于
37℃融化,破裂细胞,加入 1%LDOPA溶液 10μL/孔,以 L-DOPA为本底进行校正,
以不加美白剂培养的细胞作为对照,37℃反应 30min,置酶标仪测定 450nm处
A450值。
4统 计 学 分 析
采 用 Excel2013和 SPSS21软 件 处 理 实 验 数 据 ,计 算 结 果 以 均 值 ±
标 准 差(Mean±SD)表 示 ,采 用 邓 肯 多 重 比 较 法 进 行 显 著 性 差 异 检 验 。
二、实验结果
1总 酚 质 量 分 数 测 定 结 果
香 水 莲 花 提 取 物 中 总 酚 质 量 分 数 如 图 1所 示 ,不 同 体 积 分 数 乙 醇 提
取 的 黄 色 与 蓝 色 整 花 提 取 物 中 ,总 酚 质 量 分 数 趋 势 一 致 。
且 蓝 色 整 花 醇 提 物 的 总 酚 质 量 分 数 普 遍 高 于 相 同 浓 度 黄 色 整 花 醇 提
物 ,由 图 可 知 蓝 色 整 花 体 积 分 数 60%醇 提 物 中 酚 类 物 质 质 量 分 数 最
高 ,占 提 取 物 干 基 质 量 的 (31.62±0.14)%,显 著 高 于 黄 色 整 花 的 总
酚 质 量 分 数 (30.29±0.19)%(P<0.01),子 房 提 取 物 总 酚 质 量 分 数
最 低 ,为 (5.19%±0.18)%。
2黄 酮 质 量 分 数 测 定 结 果
如 图 2所 示 ,香 水 莲 花 提 取 物 中 黄 酮 质 量 分 数 随 提 取 溶 剂 乙 醇 体 积
分 数 升 高 而 增 加 ,且 黄 色 整 花 提 取 物 所 含 黄 酮 高 于 蓝 色 整 花 ,用 60%
乙 醇 提 取 时 ,这 两 种 整 花 提 取 物 所 含 黄 酮 分 别 占 干 基 质 量 的
(5.37±0.05)%和 (3.72±0.06)%,而 在 100%乙 醇 提 取 时 分 别 上 升
至 (10.42±0.05)%、(6.35%±0.03)%,增 加 了 将 近 一 倍 。子 房 提 取
物 的 黄 酮 质 量 分 数 最 低 ,为 (1.90±0.04)%。
由 此 可 见 ,香 水 莲 花 中 低 极 性 的 黄 酮 质 量 分 数 比 高 极 性 的 多 。
3抑 制 酪 氨 酸 酶 活 性 测 定 结 果
酪氨酸酶是酪氨酸转变为黑色素的主要限制酶,可催化含酚基化合物(如酪氨酸、
酚类化合物等)氧化成多巴醌,经一系列中间反应后形成黑色素,反应过强可引
起黑素过多症,如雀斑、黄褐斑等。
如图 3所示,不同体积分数乙醇溶剂提取的黄色整花提取物对酪氨酸酶活性的抑
制效果与蓝色整花提取物一致,子房提取物较低,熊果苷较高。该结果与提取物
中总酚质量分数趋势一致,推测提取物中含有能抑制酪氨酸酶活性的酚类物质。
由表 2可知,相同质量浓度下,蓝色整花提取物对酪氨酸酶活性抑制率的 IC50
值普遍低于黄色整花提取物,因此蓝色整花提取物的抑制酪氨酸酶活性效果好。
用体积分数 60%乙醇提取的黄色、蓝色整花提取物均具有良好的抑制酶活性效
果,其中体积分数 60%蓝色整花醇提物在所有香水莲花样品中抑制酪氨酸酶活性
效果最好,IC50值仅为(0.59±0.01)mg/mL,抑制效果与熊果苷无显著差异。
4细 胞 形 态 观 察 结 果
传代的 B16小鼠黑素瘤细胞主要为两极贴壁生长的上皮型细胞,偶见三极生长。
添加香水莲花提取物后进行细胞培养,结果显示:
整花体积分数 60%醇提物可干扰细胞增殖,使细胞生长受到抑制,而熊果苷和子
房提取物对细胞生长无明显影响。
从图 4可见,对照组细胞生长良好,形态正常,添加 100μg/mL质量浓度的熊果
苷和子房提取物的细胞生长状况与对照组相近,而在香水莲花提取物作用下,细
胞分布稀疏,尤其是添加了蓝色整花体积分数 60%醇提物培养的细胞,细胞树状
突起减少、缩短,许多细胞呈圆形或不规形状孤立存在,细胞之间很难相互融合
形成网状互联结构,导致细胞旁分泌和细胞间隙通讯减弱,难以实现细胞正常生
理功能。
5细 胞 增 殖 率 测 定 结 果
由 图 5所 示 ,香 水 莲 花 60%醇 提 物 在 低 质 量 浓 度 时 ,对 细 胞 生 长 无
明 显 影 响 ;当 质 量 浓 度 达 到 50μg/mL时 ,黄 色 和 蓝 色 整 花 体 积 分 数
60%醇 提 物 对 B16小 鼠 黑 素 瘤 细 胞 增 殖 开 始 有 显 著 抑 制 作 用 ,增 殖
率 分 别 为 (90.17±3.23)%和 (83.59±2.04)%;
在 100μg/mL浓 度 下 ,添 加 黄 色 、蓝 色 整 花 60%醇 提 物 的 细 胞 增 殖
率 分 别 下 降 到(84.44±1.77)%、(48.24±3.14)%,显 著 低 于 熊 果 苷 ,
可 见 醇 提 物 中 活 性 成 分 能 够 减 缓 瘤 细 胞 增 殖 。
许 多 文 献 报 道 ,天 然 植 物 提 取 物 如 芦 荟 苦 素 和 甘 草 提 取 物 能 够 有 效
抑 制 黑 素 瘤 细 胞 增 殖 ,起 到 美 白 作 用 。
添 加 了 熊 果 苷 培 养 的 细 胞 增 殖 率 为 (98.89%±2.55)%,说 明 熊 果 苷
对 细 胞 增 殖 无 显 著 影 响 。
子 房 提 取 物 具 有 少 许 促 进 细 胞 生 长 的 作 用 ,可 能 是 因 为 子 房 提 取 物
中 含 有 糖 类 等 营 养 成 分 ,被 细 胞 吸 收 利 用 从 而 促 进 增 殖 。
6黑 素 质 量 分 数 测 定 结 果
黑素存在于表皮的基底层,它是决定皮肤颜色的主要因素。皮肤中黑色素质量分
数越少,则肤色越浅。
由图 6可知,香水莲花提取物均有抑制细胞合成黑色素的作用,以空白对照的单
个细胞内黑素质量分数为 100%,则添加提取物后黑素质量分数明显降低,并呈
现剂量-效应关系。
在 100μg/mL时,添加黄色整花体积分数 60%醇提物培养的细胞中黑素相对质量
分数减少了 30.31%,蓝色整花体积分数 60%醇提物减少 33.02%,抑制黑素合成
效果均良好,但由于其为混合初提物,而熊果苷为纯物质,其抑制效果没有熊果
苷好。子房提取物对黑素生成的抑制也有一定效果,100μg/mL质量浓度时使单
个细胞内相对黑素质量分数减少 20.90%,但不如整花提取物。
7酪 氨 酸 酶 活 性 抑 制 率 测 定 结 果
黑色素合成过程中的关键酶主要有 3种:酪氨酸酶、多巴色素互变酶和 5,6-二羟
吲哚-2-羧酸氧化酶,一般可通过抑制酪氨酸酶的活性从而减少黑色素的合成量。
如图 7所示,随着浓度升高,提取物和阳性对照熊果苷对酪氨酸酶活抑制率均逐
步上升,在 100μg/mL质量浓度时,蓝色整花体积分数 60%醇提物与熊果苷对酪
氨酸酶活性的相对抑制率相当,达到(59.47±3.40)%,显著高于黄色整花 60%醇
提物,子房提取物对酶活的抑制效果并不明显。
该结果与 B16小鼠黑素瘤细胞内黑素相对含量的结果相一致,也与体外酪氨酸酶
活性抑制率具有一致性,因此,实验表明香水莲花提取物有较好的降低细胞内酪
氨酸酶活性的作用,从而有效减少细胞内黑色素的合成量。
三、结语
本文通过体外法测定酪氨酸酶活性和细胞模型法测定黑素含量等指标研究了香
水莲花提取物的美白效果。
酪氨酸酶是一种含铜的金属氧化还原酶,广泛分布于动植物、微生物及人体中,
具有单酚酶和二酚酶活性,酪氨酸酶位于黑色素体膜上,其活性中心的双核铜离
子在酶催化中起重要作用,是黑色素生成的关键酶,其活性越强,则黑色素合成
数量越多,肤色越深。
体外以酪氨酸为底物测定酪氨酸单酚酶活性的结果表明:
不同体积分数乙醇提取的黄色和蓝色整花提取物对酪氨酸酶活性的抑制效果强
弱具有一致性,均为体积分数 60%醇提物效果最好,表明整花提取物具有较好的
抑制酪氨酸酶单酚酶活性的作用。
同浓度时蓝色整花提取物抑制效果较黄色整花提取物和子房提取物好,可能是由
于蓝色整花提取物中酚类含量较高。蓝色整花体积分数 60%醇提物对酪氨酸酶活
性的抑制率与熊果苷相当,表明其具有很好的美白功效。

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